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Krause, Matthias (1999)
Languages: German
Types: Research
Subjects: doctoral thesis
ddc: ddc:570, ddc:57, ddc:5

Classified by OpenAIRE into

mesheuropmc: macromolecular substances
Die Ena/VASP Proteinfamilie (VASP, Mena und Evl) ist an der Regulation der aktinvermittelten Bewegung tierischer Zellen beteiligt. Deren N-terminale Ena/VASP Homologie Domäne 1 (EVH1-Domäne) bindet an ein spezifisches prolinreiches Motiv in den Zytoskelettproteinen Zyxin, Vinculin und dem Listerienprotein ActA. In der vorgelegten Dissertation wurden bekannte und neue Bindungspartner der EVH1-Domäne der Ena/VASP Familie charakterisiert. Gegen das humane Zyxin, wurden monoklonale Antikörper hergestellt und eingehend charakterisiert. Um die Dynamik von Zyxin in vivo untersuchen zu können, wurde es als GFP-Fusionsprotein exprimiert und mit Rhodamin-markiertem Vinculin verglichen. Zyxin und Vinculin werden zum gleichen Zeitpunkt während der Bildung fokaler Kontakte eingebaut, aber während des Abbaus und der Bewegung ist Zyxin schnell nicht mehr zu detektieren, während Vinculin länger verbleibt. Mit polyklonalen Antikörpern, die gegen die Bindungsstelle der EVH1-Domäne im ActA Protein hergestellt wurden, konnte ein neuer Bindungspartner der EVH1-Domäne, Fyb/SLAP, kloniert werden. Fyb/SLAP kolokalisiert in Lamellipodien sich ausbreitender Thrombozyten mit F-Aktin und VASP und in aktivierten Jurkat T-Zellen an der Kontaktstelle mit anti-CD3 beschichteten Beads mit F-Aktin, WASP, Vav und Evl. In einem funktionalen Assay konnte gezeigt werden, daß die Proteine der Ena/VASP-Familie für die Aktinreorganisation, die während der T-Zell Aktivierung stattfindet, essentiell sind. WASP und Fyb/SLAP lassen sich in vivo als Komplex koimmunpräzipitieren. Dieser Komplex könnte die ActA analoge Funktion haben, die Aktinnukleation und -polymerisation zu induzieren und wäre damit das erste zelluläre Äquivalent zu ActA. The Ena/VASP protein family (VASP, Mena and Evl) is implicated in the regulation of the actin based motility of animal cells. Their N-terminal Ena/VASP homology domain 1 (EVH1 domain) binds to a specific proline-rich motif found in the cytoskeletal proteins zyxin, vinculin and the listerial protein ActA. In this Ph.D. thesis, both known and newly identified binding partners of the EVH1 domain were characterized. Monoclonal antibodies were raised against human zyxin and characterized in detail. To analyze the in vivo dynamics of zyxin it was expressed as a GFP-fusion protein and compared with rhodamine-labeled vinculin. Zyxin and vinculin were incorporated at the same time point during the formation of focal contacts, whereas during focal contact movement and desintegration zyxin disappeared much more rapidly than vinculin. A new binding partner of the EVH1 domain, Fyb/SLAP, was cloned using polyclonal antibodies raised against the EVH1 domain binding site within ActA. Fyb/SLAP was found to colocalize with F-actin and VASP in lamellipodia of spreading platelets, and with F-actin, WASP, Vav and Evl at the contact site of anti CD3 coated beads on activated Jurkat T-cells. Using a functional assay it was shown that the proteins of the Ena/VASP family are essential for the actin reorganization that occurrs during T-cell activation. WASP and Fyb/SLAP could be co-immunoprecipitated in vivo as a complex. This complex might function to induce actin nucleation and polymerization and thus might be the first example of a cellular ActA analogue.

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